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北京治疗白癜风哪里便宜 http://m.39.net/news/a_5196871.html一、流式细胞术及流式细胞仪.流式细胞术定义流式细胞术(Flowcytometry,FCM)是利用流式细胞仪(flowcytometer)对血液、各种体液、骨髓、活检以及动植物的单细胞悬液、石蜡包埋组织中的有形成分包括细胞、血小板、细胞器、精子、微生物以及人工合成微球等的多种生物和物理、生化特性进行计数和定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的细胞参量分析技术。迄今已有近50年历史，发展自0世纪70年代，80年代从基础研究走到临床研究及疾病诊断和治疗监测领域。.流式细胞仪概述流式细胞仪集激光、紫外光等多光源、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学、荧光染料、标记技术、计算机及其软件为一体，具有分析和分选细胞功能，对细胞悬液进行快速分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标。同传统的荧光显微镜检查相比，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪的测量可大可小，可内可外。可测量细胞大小、内部颗粒性状，也可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平分析，短时间内分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度95%。新试剂的不断发现使试验费用日益降低，FCM从研究室逐步进入临床实验室，成为重要的常规实验诊断手段，为临床提供重要的诊断依据。目前，已普遍用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学、药物学、分子生物学等临床医学和基础医学领域。.流式细胞仪分类流式细胞仪按功能结构分为分析型和分选型。分析型价格不高，分选型则价格超贵。传统流式存在光谱渗漏、自发荧光等问题，使用的荧光染料数量越多，问题越大。为克服这些问题，出现了质谱流式和光谱流式。质谱流式标签系统（金属元素）和检测系统（ICP质谱技术）不同，最大特点是超高分辨率，通道数量大大提升、无需计算荧光补偿、没有自发荧光（细胞内部不含镧系元素离子）等；光谱流式是从另一条路解决荧光补偿问题，即光谱解析。不同荧光素有其独特光谱特征，通过事先学习荧光素的光谱特征，智能消除传统流式的荧光渗漏影响。科研型功能齐全，分析灵活，但操作繁琐，须由经过正规培训的专业技术人员操作。临床型仪器易于操作，稳定性好，分析速度快，适合临床实验室使用。..分析型用于快速分析检测细胞组分及颗粒悬液，同时检测分析液流中细胞上多种信号，对细胞加以区分鉴别，临床检验主要使用此类流式细胞仪。..分选型用于快速分离获取目的细胞，在分析基础上，通过分选模块对细胞加以分离。电荷式分选是主流分选方式，具有分选效率、纯度高，不易污染等特点。..全自动式根据临床常规检验需求，为进一步简化临床操作，全自动式流式细胞仪具有自动样本加样、溶血、检测，检测结果通过双向LIS自动上报等类似血细胞分析仪的全自动化功能，大大提高了实验室的工作效率和管理效率，减少人为错误。..图像型将流式多色检测技术和荧光显微镜图像显示技术相结合的一种流式细胞仪，通过荧光信号强度及荧光图像对细胞亚群定性和定量分析。二、流式细胞仪工作原理.流式细胞仪原理流式细胞仪工作原理是将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。以激光作为发光源，经聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，荧光染色细胞在激光束照射下，产生散射光和激发荧光。图流式细胞仪工作原理两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，基本反映了细胞体积的大小；荧光信号接受方向与激光束垂直，经过系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成不同波长的荧光信号。荧光信号强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或其核内物质浓度，经光电倍增管接收后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续电信号转换为数字信号。计算机把测量到的信号进行计算机处理，将分析结果显示在屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件形式存储在硬盘上以备日后查询或分析。图流式细胞仪构造细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴实现的。在流动室喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散液滴之中。将液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，实现细胞的分离分选。图经特异性荧光染料染色细胞.流式荧光技术流式荧光又称悬浮阵列、液相芯片等，是近0多年逐渐发展起来的多指标联合诊断技术。美国Luminex公司是主要仪器厂商之一。该技术以荧光编码微球为核心，包含两大核心技术，荧光编码微球技术和双激光流式技术。可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等多方面研究。荧光编码聚苯乙烯微球直径5.6微米（约为头发丝直径的十五分之一）、大小均一、能长久悬浮于液体中。微球表面包被有特异性抗体或核酸探针，与样本中待检分子特异性结合。经两种荧光染料染色编码，可获得00种不同特征荧光谱的微球，不同荧光编码微球连接不同抗体或核酸探针并可在同一反应体系内进行高效均匀的液相动力学反应。同一反应体系内不同编码微球各自反应、互不干扰，实现一次检测获得00种检测结果，实现多指标的高通量联合检测。图荧光编码微球双抗夹心液相反应图示流式荧光技术特点如下：（）高通量：将许多种不同荧光编码的微球放在同一反应体系内，一次可同时检测-种生理病理指标，这与传统方法的逐个检测相比是质的飞跃。（）高敏感性：流式荧光技术最高检测下限可达0.0pg/ml，常规酶联免疫吸附试验(ELISA)为μg级，比后者检测的灵敏度提高0—00倍。（）线性范围宽：检测线性范围比常规ELISA方法高0倍以上，可达-5个数量级。检测浓度范围为pg-μg级。（）反应快速：因流式荧光技术的杂交或免疫反应在悬浮的液相中进行，反应时间短(从h缩短到0—0min)，杂交后常不用清洗即可直接读数，检测效率高于固相杂交。（5）重复性好：杂交发生在准均相液体环境中，其结果稳定，重复性非常好。检测时，抽取其中的00颗微球读数，最终的数据取其均值或中位值，可将误差减到最小。（6）利于探针和被检测物的充分反应：由于液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，所以也更有利于探针和被检测物的反应。（7）操作简便：流式荧光技术平台的整个反应过程只涉及加样和孵育，最后上机读数，操作步骤少，简单易用。三、流式细胞仪的应用我国在上世纪80年代初引进第一台流式细胞仪。流式细胞仪中科研领域和临床领域各占一半左右，目前仍处于仪器导入期。除了中心实验室及检验科以外，应用的临床科室主要集中在血液科、肿瘤科等。此外，疾控系统也应用于HIV监测。流式细胞仪临床常见检测项目包括：淋巴细胞表型检测、HLA-B7检测、睡眠性阵发性血红蛋白尿CD55/CD59检测、白血病、淋巴瘤免疫分型及微小残留病检测、CD+干细胞计数、细胞周期分析和细胞凋亡检测等。图5截至09年流式细胞仪用户群体数量图60医院流式细胞仪临床科室应用分布来源：华创证券.临床检测应用..血液病诊断和治疗监测通过荧光抗原抗体检测技术可对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。各种血细胞系统都具有独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用。例如干细胞表达CD，髓系表达CD、CD，B细胞系表达CD0、CD9、CD0等，T细胞系表达CD、CD、CD5、CD7，利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平，协助临床确诊。近两年白血病分子特征研究取得明显进展，尤其是对染色体易位形成的融合基因，有些已作为诊断不同类型白血病的分子生物学特异性标志和确定诊断的唯一依据。基于此，在流式荧光技术基础上推出的白血病融合基因检测项目，可以一次检测种常见融合基因，覆盖50%以上初发病例，并且灵敏度高、特异性好，省时、省力、省标本。检测结果不仅可以为白血病诊断、分型、临床治疗和预后判断提供重要依据，同时也是白血病微小残留病的检测基础。()白血病诊断和治疗评价白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的诊断分型更加科学化和规范化;可检出×06个有核细胞中的一个白血病细胞，在白血病的早期诊断方面有着其它方法无可比拟的特异性和敏感性。白血病患者体内融合基因转录本的拷贝数随病情进展逐渐升高;随病情好转逐渐下降，并且早于细胞遗传学的染色体核型分析。因此融合基因检测可以早期准确地诊断微小残留病，防治白血病复发，也是指导临床治疗、评价治疗效果和预测复发的实验室指标。同其它肿瘤的治疗一样，测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。目前，临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD、HLA-DR、CD等细胞表面标志物，成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态，可以对预后做出早期的判断。（）网织红细胞测定网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标，FCM通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA结合，定量测定网织红细胞中RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。此外FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义。为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。（）其他血细胞疾病诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞CD55、CD59抗原表达减低是该病的特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族，是重要的补体调节蛋白，它通过与补体C8、C9的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体激活溶解。..在肿瘤学中的应用()协助肿瘤早筛人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。()肿瘤诊断、预后判断和治疗监测FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化。可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案。.在血栓与出血性疾病的应用正常情况下血小板以分散状态在血管内运行，但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况成为检查血小板功能的一种新手段。该方法灵敏、特异性高。如果采用全血法测定，只需微量标本，适合于儿童及血小板减少性疾病的患者。血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变，FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白IIb/IIIa，CD6，CD6等)监测血小板功能及活化情况，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。此外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化，借助于钙离子敏感荧光探针的帮助，用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体，结合在血小板表面，称为血小板相关抗体，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板，FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体，间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。.细胞因子检测预警危重症患者细胞因子风暴，分清SIRS/CARS/MARS和对因精准治疗评估炎症（感染/自免疾病/创伤/手术等）疾病进展/转归和治疗效果评估肿瘤患者病情进展和治疗效果，检测CAR-T和PD-治疗不良反应指导糖皮质激素和免疫调节剂使用。四、流式荧光染料分类流式细胞学的发展，最重要的促进力量是抗体，其次就是与仪器检测能力配套的荧光染料。荧光染料目前仍跟不上仪器检测通道数量的发展。现有的流式荧光染料可分为以下大类：.有机小分子有机小分子主要指FITC（分子量89Da）、AlexaFluor88（FITC类似物，分子量6Da）、TexasRed（TxRed，分子量65Da）、AlexaFluor67（分子量55Da）、PacificBlue（分子量Da）和Cy5（分子量76Da）。这些有机小分子具有一致的发射光谱和较小的斯托克斯位移（激发波长和发射波长之间的差，大约为50-00nm），光稳定好，容易与抗体偶联，所以应用广泛。值得一提的是AlexaFluor染料光稳定性较FITC更好，所以做成像可选择它们。.藻胆蛋白藻胆蛋白（Phycobiliproteins）是从蓝藻、鞭毛藻等藻类中提取的大蛋白分子，例如藻红蛋白（PE）的分子量为0,Da。这些蛋白质具有较大的斯托克斯位移（75-00nm），并且具有稳定的发射光谱。由于藻胆蛋白较大，在结合过程中通常具有：的蛋白质与荧光染料比率，对于定量流式细胞术非常有用。但藻胆蛋白易受光致漂白，不建议长时间或反复暴露于激发光源中。藻胆蛋白家族中，除了藻红蛋白（PE）外，还有别藻蓝蛋白（APC）和苦瓜素叶绿素蛋白（PerCP）。.量子点量子点（Qdots）是半导体纳米晶体，具有与纳米晶体尺寸密切相关的荧光发射光谱。适合被紫外或紫光激发，但也容易被其它激光少量激发，在多参数实验中使用Qdots时，其它波长激光器的这种微小激发，却会使荧光补偿变得复杂。因此，虽然量子点染料亮度高，但由于补偿问题难以解决，且将Qdot结合到抗体上较为困难，所以这些试剂在多参数方案中大多被高分子染料取代。.高分子染料高分子（聚合物）染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基，“调节”吸收和发射特定波长的光。这些染料非常稳定，与藻胆蛋白具有相似的量子效率，光稳定性大大提高。可以使聚合物染料仅吸收特定波长的光，避免了Qdots存在的跨波长激发的问题。高分子染料中典型的代表是BrilliantViolet(BV)、BrilliantUltraviolet(BUV)和BrilliantBlue(BB)。.5串联染料串联染料将藻胆蛋白（PE，APC，PerCP）或高分子染料（BV，BUV95）与有机小分子荧光染料（Cy，Cy5，Cy7）化学偶联，利用荧光能量转移（FRET），形成单激光激发更多波长的发射光。例如，TexasRed的最大激发为nm，而PE的发射为nm，因此通过将PE与TexasRed耦合，PE的发射光通过FRET激发TexasRed，从而使PE-TxRed可用88nm或5nm的激光器激发。高分子抗体也可串联有机小分子染料。串联染料非常亮，具有较大的斯托克斯位移值（50-00nm），检测低密度的抗原时非常有用。但是，串联染料的稳定性不如供体荧光染料，能量转移效率因批次而异，使补偿复杂化。.6重金属离子重金属离子严格说不算荧光素，用于质谱流式的抗体，不是用荧光素结合的，而是与镧系元素系列中的单个同位素重金属离子结合。目前商业上有5种镧系元素同位素可用于抗体偶联。这些探针是非荧光性的，仅适用于质谱流式分析。.7荧光蛋白荧光蛋白经常用作基因表达的报告系统。最常用的是来自维多利亚水母（Aequoreavictoria）的绿色荧光蛋白（GFP）。由此衍生出CFP和YFP。红色荧光蛋白（DsRed）来自蘑菇海葵Discosoma，从DsRed衍生出下一代单体荧光蛋白（mCherry，mBanana），具有更宽的激发和发射光谱。随着基因克隆技术的成熟，目前荧光蛋白已有数百种，其激发和发射光谱范围从紫外线到近红外。.8核酸染料核酸染料结合DNA、RNA或两者均结合。用于定量DNA进行细胞周期分析（如PI，7-AAD，DyeCycleViolet，DAPI），分选染色体（如Hoescht，ChromomycinA），利用侧群分析对干细胞进行分选（如Hoescht），死活细胞区分以及对细菌进行分选。将核酸染料与另一种标记物（例如荧光染料偶联的抗溴脱氧尿苷（BrdU））结合使用，能确定增殖水平。.9细胞增殖染料用BrdU（溴脱氧尿嘧啶核苷）孵育细胞，使其掺入细胞DNA合成过程，然后用针对BrdU的抗体和DNA染料染色，便可测量细胞增殖。但是不适合长期增殖研究。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。现在已有CFSE染料的红色和紫色变种。这些染料在合适浓度下，不影响细胞生长或形态，适合长期增殖研究。.0细胞死活染料细胞活力通过排除性染料（如碘化丙啶、DAPI）确定，也可通过染料与细胞内胺类物质的结合检测。排除性染料不能固定，仅适用于无感染性且需立即分析的细胞。胺类染料包括Live/Dead（ThermoFisher），Zombie（Biolegend）或FixableViablity（BDBiosciences），适用于固定的细胞，适合有传染性细胞、胞内抗原染色的细胞、多聚甲醛固定的细胞。.钙指示剂染料钙指示剂染料与钙结合后发生色移，用于指示细胞激活和信号传导。最常用的染料是indo-，即紫外双相钙探针。另外还有fluo-的Blue-greencalciumprobes。（完）预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇 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