|
作者：郭涛程志鹏 1、研究背景 静脉血栓形成是世界上致死和致残的主要疾病之一，在西方国家的发病率约为1/。近年荷兰的一项对近例静脉血栓患者长达8年的随访研究显示，其年病死率为/10万，为正常人群年病死率的4倍。长期以来，国际上认为亚洲人群静脉血栓的发病率较低。但随着亚洲地区（特别是中国地区）医疗卫生水平的提升和诊疗手段的丰富，近年来的研究显示，静脉血栓在亚洲地区（特别是中国）的危害愈发显现。 静脉血栓是复杂的多基因-环境因素疾病，家系分析以及孪生子研究表明，静脉血栓形成约有60%由遗传因素控制。在欧美国家，已经发现了与欧美人群静脉血栓形成有关的多种常见遗传危险因素，其中FactorVLeiden和ProthrombinGA变异的个体患静脉血栓形成的风险显著增加。由于不同民族存在遗传背景的差异，这两种多态性在中国人群中非常罕见。以往包括中国在内的亚洲地区并未报道重要的静脉血栓遗传危险因素，直到近年来陆续发现了一些重要的中国人群静脉血栓遗传危险因素。此次讲评的文章即是众多相关研究中的优秀代表。 2、研究概述 2.1技术路线 研究者选择血栓调节蛋白（TM）的编码基因THBD作为目的基因，从静脉血栓标本库中随机选择60例组成静脉血栓组，同时设置正常对照组。针对THBD基因进行扩增和测序，并对发现的常见基因变异通过酶切进行病例对照分析，一级亲属静脉血栓形成的相对危险度研究以及该基因变异的功能试验。 2.2基因检测 研究者先剔除了当时巳知的基因变异者和蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗凝血酶（AT）活性低于正常范围者，然后采用病例-对照研究的方法进行THBD基因重测序研究。在60例静脉血栓患者中发现了10种THBD基因的变异（1个位于启动子区域，1个位于5UTR，5个位于编码区，3个位于3UTR)。经分析预测THBDc.—GT有可能是与静脉血栓相关的变异，所有的后续研究均围绕该突变进行。 首先对该突变在所有病例组和对照组人群中进行基因分型检测。设计PCR-RFLP分型方法，选取能特异性识别突变位点的MwoI作为限制性内切酶。酶切后的混合物经琼脂糖凝胶电泳分离，使用紫外凝胶成像系统观察分型结果。随机选取96份DNA样本，用测序的方法与PCR-RFLP方法相比较，判断分型结果的准确性。结果与限制性酶切分型结果一致，表示PCR-RFLP的分型方法准确可靠。病例对照研究显示：对于THBDc.—GT突变，杂合突变型人群患静脉血栓的风险是野生型的2.8倍。此外，重测序还发现了5种罕见的致病突变（c.GT、c.CG、c._delinAA、c.TG、c.*6_*23del）。合计突变比例为5/，相对与其他静脉血栓遗传因素比例较高。 2.3蛋白检测 研究者检测了血浆中TM的水平。目前尚无方法检测内皮细胞表面TM的水平，但是血浆存在内皮细胞脱落的TM（即游离TM），选用ELISA的方法检测其水平。检测c.—GT杂合子以及对应的野生型个体48例。在各分组中，突变杂合子游离TM的平均水平均显著低于野生型个体游离TM的平均水平。 2.4家系研究 在分析一级亲属静脉血栓形成的相对危险度时，为了防止选择偏倚，研究者仅分析了先证者的一级亲属，而没有纳入先证者。总共例成员加入研究，收集每例成员的血液标本进行血浆AT、PC、PS活性检测以及PROC、PROS1、SER-PINC1、THBD突变分析。在研究的例一级亲属中有81例为突变杂合子，其中1例同时伴有PROCc._del多态性；另外95例为野生基因型，其中1例同时伴有PS缺乏症。这些亲属共有16人次静脉血栓事件，其中7例为无诱因静脉血栓形成棳例存在获得性危险因素。一级亲属中，杂合子组年静脉血栓发病率为3.41/，显著高于野生型组0.94/，杂合突变对静脉血栓的相对危险度为3.42。 2.5功能研究 研究者分别转染的Firefly荧光素酶质粒（F-luc）为4种：pGL3-WT、pGL3-MT、pGL3-basic、pGL3-promoter。pGL3-WT、pGL3-MT含有野生型和突变型的THBD启动子区域片段（56bp），pGL3-basic不含任何启动子序列，而pGL3-pro-moter含有SV-40强启动子序列作为对照。同时共转染内参照Renilla荧光素酶报告基因（R-luc）。瞬时转染3种细胞：人脐静脉内皮细胞、HEK-细胞、COS-7细胞。结果显示：与WT启动子相比，c.一GT突变使3种转染细胞内荧光素酶报告基因的表达水平均显著下降。 3、研究价值 3.1研究特色 此研究是首批中国人群静脉血栓常见遗传危险因素研究之一，虽然所发现的基因变异频率相对低（微小等位基因频率小于5%），但对静脉血栓有着较高的优势比（OR值2.8），因而在血栓形成中发挥重要作用。这与其他遗传学研究的发现不同。在目前大多数的遗传学研究中（例如全基因组关联分析），多考虑高频率变异，所发现的有统计学意义的基因变异也为高频率变异（微小等位基因频率大于5%甚至10%），但对疾病的优势比很小（OR多小于1.2），因而在血栓形成中发挥的作用较小，在同时考虑、校正其他的危险因素后往往可忽略不计；同时，这些位点多处于基因的非编码区甚至基因间隔区，无法在生物学上解释疾病关联。因此，低频率变异在血栓形成中的作用更为重要；同理可推知，对于其他的多基因疾病如糖尿病、冠心病，低频率变异的研究也更有价值。 3.2研究意义 血栓性疾病已成为威胁人类生命健康的一类主要疾病，目前全球每年用于血栓性疾病治疗的费用高达数百亿美元。有关血栓病基因筛查的研究不仅有重大的学术价值，还可望在普通人群中和静脉血栓家族中开展早期诊断，早期发现携带血栓易感基因的人群，从而达到早诊断、早治疗的目的，能有效降低此类疾病的发病率、致残率和致死率。这对于提高我国人民的健康水平、保护社会劳动力将具有重要的意义，因而社会效益巨大。 遗传学研究和分子诊断的重大意义也在于指导静脉血栓患者个体化治疗，为先证者家族成员提供早期诊断和临床前预防依据。例如，血栓性疾病患者若诊断为遗传性AT缺乏症（SERPINC1基因突变），选用肝素治疗效果往往不佳，这是因为肝素是AT的辅因子，最终还是需要通过AT发挥抗凝作用。这种情况下，使用华法林或者凝血因子X抑制剂抗凝治疗效果较好，如选用肝素，初始负荷剂量要相应增加。如果分子诊断证实存在单一或者复合遗传缺陷，同时血栓形成反复发生者，原则上需要长期抗凝治疗；存在遗传缺陷的初发血栓形成者，以及尚未发现遗传缺陷的复发性静脉血栓形成者，需治疗后密切随访观察；不存在遗传缺陷的初发血栓形成者，原则上无需长期抗凝治疗。 同时，研究发现的THBDc.—GT是中国人群静脉血栓形成密切相关的遗传危险因素。这对未来的血栓遗传学研究有重要的提示，即在各个国家、民族、人群中，开展大规模的止血相关基因重测序研究，才能有助于发现真正的与本研究人群血栓形成有关的遗传易感因素。这一点对非洲人群更为有用，因为研究表明非洲国家的静脉血栓形成发病率是各民族中最高的，然而至今尚未发现与非洲人群静脉血栓相关的常见遗传危险因素。 4、展望 静脉血栓形成在全世界范围内有较高的危害，其中遗传性因素在静脉血栓的发病中起到决定性作用。本研究选择TM的编码基因THBD作为目标基因，取得了突出的研究成果。自上世纪60年代起，世界范围内陆续报道了数十个能增加静脉血栓风险的基因，主要易栓基因的发现时间和相对风险如图1所示[框内为得益于全基因组关联研究（GWAS）技术而发现的易栓基因。近年来，由于GWAS和外显子组研究技术迅速发展，发现了数百种与多基因疾病相关的高频率危险等位基因以及一些与疾病相关的新的候选基因，为疾病发生的生物学过程指出了一些新的机制。然而对大部分GWAS来说，始终不能准确定位有害基因变异的位置，也不能在生物学上解释相关多态性的功能影响。并且通过GWAS技术发现的多数易栓基因相对危险度较低，多数在1.2以内。 家系分析在发现高相对危险度的易栓基因中仍然发挥重要作用。近年的报道发现，未携带目标易栓基因的家系成员，发生静脉血栓的风险同样有一定程度的提高，提示还可能存在已知易栓基因之外的遗传性致病因素。 此外，携带多种易栓基因的人群静脉血栓发病率明显增加，提示静脉血栓的危害评估可能会形成多种基因突变累加的积分形式暡暢。有研究表明，深静脉血栓和肺栓塞作为静脉血栓的主要成员，两者的遗传性致病因素也存在较大差异，必要时可将两者作为独立的病种进行研究。 总之，随着对静脉血栓遗传危险因素的深入研究，发现了越来越多的静脉血栓致病基因，本文的技术路线可作为静脉血栓遗传危险因素研究的参考。随着基因诊断越来越多的应用于临床，期待通过研发新的靶向性治疗药物以及新兴基因修复技术来更加有效的治疗静脉血栓。 来源：临床血液学杂志 ==========欢迎您白癜风怎样快速治疗北京学生治疗白癜风费用 |
