二十世纪四、五十年代凝血因子的新发现，推动了凝血机制认识的发展。年Quick首次描写了凝血酶原时间（Prothrombintime,PT）测定,时至今日PT以及此后发展的活化部分凝血活酶时间（Activatedpartialthromboplatintime,APTT）、凝血酶时间（Thrombintime,TT）、纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)等测定已成为临床凝血功能检查的常规项目，为临床诊断和治疗提供了重要帮助。近二十年来随着科学对凝血机制认识的进一步深入以及检验仪器及技术的迅速发展，血凝及血栓性疾病的实验室诊断技术和方法又有了很大进步。一方面，常规的凝血检查向标准化、规范化和实验室间可比化发展，另一方面，对血小板、D-二聚体(D-dimer)和纤维蛋白（原）及其降解产物（Fibrindegradationproduct,FDP）在凝血功能中的重要性有了深入认识，同时还发现了一些新的促凝物质。功能各异的凝血功能自动化检测仪器，如全自动凝血功能检测仪、全自动血流变检测仪、血小板聚集仪和血栓弹力图仪等不断推出。本文旨在总结凝血机制研究及检查的新进展、新发现，同时对凝血机制检查的全自动仪器作一介绍。

一、凝血功能检查的新进展

1．凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）测定的标准化年卫生部颁布了号文件，即《出血时间、凝血时间检测方法操作规程的通知》，淘汰了手工玻片法凝血时间和Duke法出血时间测定。规定用APTT或全血凝固时间（Clottingtime,CT，试管法）测定取代凝血时间测定的玻片法和毛细管法；用ATPP、血浆PT和血小板(PLT)计数联合检测取代出血时间测定。PT和APTT分别是评价外源性凝血途径功能和内源性凝血途径功能的指标，是目前临床最常用的筛选试验，是凝血因子功能检测和抗凝药物疗效监测的首选试验。但相当长一段时间，由于各实验室采用的方法、仪器、试剂、标准血浆不同，使各实验室间PT结果不具可比性，也难以进行质量控制，因此，WHO于年提出PT的标准化报告方式为国际标准化比值INR（Internationalnormalizedratio,INR）。年国际血液标准化委员会（InternationalCommitteeforStandardizationinHematology，ICSH）和国际血栓与止血委员会（InternationalCommitteeonThrombosisandHemostasis，ICTH）也均指出“今后医学科学论文如其PT值以‘s’、‘比值’和‘活度’等来报告而不提供其INR值，将不予接受”。INR比值是病人PT与正常对照PT之比的ISI次方，计算公式是：INR＝PTRISI，凝血酶原时间比值PTR＝患者PT(秒)/正常参比血浆PT（秒）。ISI为国际敏感度指数（Internationalsensitivityindex,ISI）反映试剂对VitaminK依赖的凝血因子水平的敏感程度，通过国际参考品（Internationalreferencepreparation，IRP）来溯源。它是WHO以人脑凝血活酶67/40批号作为标准品，以国际敏感度指数表示各类试剂与67/40之间的关系，用多份不同凝血因子水平的血浆与国际参考制品（IRP）进行严格校准，通过回归分析求得回归斜率而得到，代表凝血活酶试剂对凝血因子缺乏的敏感性。67/40为原始参考品，ISI为1.0。要求商品化的试剂每批产品必须确定ISI值，并尽可能与1.0接近。这样，同一份标本在不同的实验室，用不同的ISI实际检测，PT值结果差异可能很大；但INR值相同，从而使测得的结果具有可比性。目前，常用的国际参考品有下列几种：（1）单一组织凝血活酶参考品：是一种组织提取物的生理盐水悬液制剂。WHO的原级凝血活酶参考品（Primaryreferencepreparation）是以统一标准的“英国比较凝血活酶”（BCT）为基础，如人脑组织凝血活酶，编号67/40。此后，又以BCT/(人脑)代替WHO早期的67/40，作为原级标准，并于年以ICSH/ICTH的名义公布。同时，又以BCT67/40为基础标化了次级参考品，如牛脑组织凝血活酶，编号68/。

（2）复合组织凝血活酶国际参考品：它是组织提取物的生理盐水悬液中加入适量的纤维蛋白原、因子ⅴ和氯化钙组成的制剂，如牛组织凝血活酶OBT/79等。世界各国都广泛应用WHO的这些参考品来校正本国或本地区制备或生产的组织凝血活酶参考品。这一系列规定的重大贡献是使实验室间检测结果具有可比性，同时便于质量控制。但是，研究者逐渐发现，随着凝血分析仪在凝血功能检查中的广泛应用，自动化仪器测得的PT结果可因仪器的型号和检测原理的不同而有差异。不仅试剂影响INR，仪器也能影响INR，而且有时会产生较大误差。如在ACL、CobasFibro和CoagaPt三台自动化凝血分析仪上使用同一种ISI为1.12的ThromborlS试剂，结果测定的PT均值分别为10.7秒、12.1秒和11.1秒。但若以同一ISI值计算INR，得出的数值也存在着不同程度的差异。为此，专家们建议，同一组织凝血活酶试剂应用于不同仪器时，可用所谓的“仪器特有的ISI”(InstrumentspecificISIs)或称区域性ISI（LocalISI）来计算INR。这就要求每台仪器所使用的凝血活酶试剂都应该有特定的重新标定ISI值，重新标定ISI值的做法是购买标有INR的冻干血浆，然后在各自的仪器上再标定所使用凝血活酶试剂的ISI值，这样才可使病人的INR具有可比性。虽然INR的应用提高了实验室间凝血检测结果的可比性，使结果更为准确、可靠，但由于PT和APTT检测受到检测前、中和后各种变异的影响，尤其是实验条件和环境、试剂与仪器、检测原理和方法等因素的影响，为实验室间检测结果的比较和质量控制带来了困难。因此，统一凝血检测标准成为凝血检测发展的必然。年至年美国临床和实验室标准化委员会CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）先后颁布了：H47-A2PT和APTT一步法实验-批准指南第二版、H54-AINR确认过程和PT/INR系统的实验室校准-批准指南、H58-A聚集仪检测PLT功能实验-批准指南。H47-A2是一个由H28-T（推荐指南）和H29-T两个推荐指南合并后形成的批准指南，是一系列血液凝集方法学指南的一部分，建议与H54-A和H57-A共同使用。指南描述了采用柠檬酸盐血浆一步法PT和APTT常规检测技术操作的原理和必要规程。实际上，这两项实验都是测定的激活测试血浆后形成纤维蛋白凝块的时间。H54-A批准指南的目的是对负责报告病人INR结果的生产厂商和临床实验室的技术人员提供指导。该指南分为两部分，第一部分定义了校准曲线、定标血浆、通用国际敏感指数、国际标准化比率、国际参考品（InternationalReferencePreparation，IRP）等的概念，并对校准过程、材料选择、精密度、不准确度等作了详细、全面的描述。第二部分是应用于临床实验室的缩写版本，适用于负责PT分析工作的专业实验室。指南提供了计算实验室ISI的方法，包括了确定直接INR的校准曲线的建立过程。在扩大的指南中，还描述了定标血浆的制备方法和确定INR值的方法。H58-A的目的是在该指南的指导下使进行血小板功能检测的实验室的检测结果取得更进一步的统一。标准对光透射聚集仪（LightTransmissionAggregometry，LTA）、全血阻抗聚集仪（WholeBloodImpedanceAggregometry）、流体切变技术(Shear-Flowtechnologies)的原理、操作细则、注意事项进行了描述，以便新、老使用者在其实验室建立一致的、可重复的血小板功能实验规程。我国国家卫生部也于年制定了WS/T-凝血因子活性测定总则，这是一个推荐标准，希望各临床实验室参照执行。标准对参考曲线（referencecurve）、参考血浆（referenceplasma）、乏因子血浆（factor-deficient）、质控血浆（controlplasma）、缓冲液（bufferedplasma）逐一作了定义。还明确了测定中所用试剂和材料，包括APTT试剂、凝血活酶、乏因子血浆、参考血浆和氯化钙的浓度，样本收集包括抽血人员要求、病人准备、采血针、采血管、抗凝剂的要求及其比例和采血技术要求，运输和贮存的条件和技术要求。这一系列指南和标准的颁布，进一步规范了各实验室对PT和APTT等凝血因子的测定，使检测结果更为可靠、准确，实验室间更具可比性，更加易于质量控制。

2．纤维蛋白原（FIB）检测及其标准化

目前，FIB的测定方法很多，可分为：（1）基于加入凝血酶后形成纤维蛋白的方法，即功能测定法或可凝固蛋白法；（2）物理—化学方法(热／盐沉淀法、双缩脲法等)；（3）免疫学方法；（4）FIB含量直接推算法（凝血酶原时间衍生法）等。功能测定法是将凝血酶加到血浆中，使纤维蛋白形成FIB凝块，收集并彻底洗涤后进行检测。根据测量方法的不同又可分为：测重法、酚试剂比色法、紫外光度法、测氮法、浊度法和凝血酶凝固时间法等。vonClauss法是最常用的可凝固蛋白法，其原理为将足够的凝血酶加到稀释血浆中，记录出现FIB凝块的时间，该时间与FIB含量成负相关。该法是一种快速、简便、特异性较好的功能性测定方法，vonClauss法为国外常规方法；改良Jacobsson法结果准确可靠，为世界卫生组织(WHO)和美国国家临床检验标准委员会(NIBCC)推荐的参考方法。该类方法测定的是有凝血功能的FIB,因此最能直接反映血浆中具有凝血功能FIB水平,所以特异性好。由PT测定衍生的PT—der法，其原理是，当PT测定完成时，纤维蛋白均变成FIB，其形成的浊度与FIB含量成正比，因此无需任何试剂即可由产生的浊度，用终点法或速率法算出FIB的含量。本法精密度相当高，当FIB含量在正常范围或轻度异常时与Vonclauss法无显著差异。该方法常用于全自动凝血分析仪的凝血功能检测。而免疫学方法是将FIB作为抗原免疫动物，制成多克隆或单克隆抗体，然后通过各种免疫学方法进行测定。该法的主要缺点是所测的不仅是可凝固的FIB，可能包括了它的降解产物(因为它们有共同抗原)，也可能包括了异常FIB。为了更准确的测定FIB的免疫学特性，相继研制出了FIB亚组份测定、纤维蛋白单体聚合功能测定和FIB基因多态性测定等。血浆FIB在SDS-PAGE电泳时可分为高分子组份纤维蛋白原(HMW、MW)、低分子组份纤维蛋白原1(LMW、MW)和2(LMW、MW)。许多研究表明FIB亚组份的改变与冠心病、心肌梗死、脑血管病的发生和发展有一定的病理联系,因此FIB亚组份的测定可能具有重要的临床意义。FIB亚组份测定方法有两类,一类是SDS-PAGE法，有MillsD方法和Holm方法。第二类是利用不同的离子强度的甘氨酸溶液将总纤维蛋白原和HMW分别沉淀，然后计算LMW，常用的是Sasaki法，Holm法稳定性和准确性较好。FIB被凝血酶作用形成纤维蛋白单体，继而发生聚合形成凝块。观察纤维蛋白单体聚合速率(FMPV)不仅能了解FIB分子对凝血酶的反应性,而且异常时有临床价值。这种测定方法称为纤维蛋白单体聚合功能测定，FMPV、凝固性FIB含量(A最大),FMPV/A最大可作为预测心梗和血栓性疾病的有效辅助手段。FIB基因多态性检测的研究，由于相关位点较多，影响因素较多，目前仍处于研究阶段。